Допинг-контроль: количественный анализ — различия между версиями

Материал из WIKIATLETICS
Перейти к: навигация, поиск
 
Строка 1: Строка 1:
−
== Качественный анализ при проведении допинг-контроля ==
+
Для многих запрещённых веществ в спорте для получения положительного результата тестов будет достаточно просто получить их наличие в моче. Так как большая часть методов диагностики и определения веществ основываются на использовании хроматографических анализов в комбинации с масс-спектрометрией, были созданы определённые правила для обнаружения химических веществ при помощи систем газовой и жидкостной хроматографии, а также масс-спектрометрии. Наличие вещества подтверждается, если относительная представленность некоего числа определённых ионов (зависит от используемого способа масс-спектрометрии) образца соизмерима с подходящим стандартным образцом. Помимо этого, период удержания веществ не должен сильно различаться (в диапазоне возможных отклонений) во время проведения хроматографии образцов мочи у спортсменов и контрольных образцов. Следовательно, для определения и обнаружения веществ в сложных для диагностики образцах, особую роль играют результаты хроматографии и масс-спектрометрии. На данный момент было проведено большое количество исследований результатов масс-спектрометрии с применением стимуляторов и маскирующих средств, вдобавок были созданы способы их обнаружения для реализации антидопинговых тестов.
  
−
Для большинства запрещенных субстанций в профессиональном спорте для позитивного результата теста достаточно просто получить подтверждение их присутствия в образце мочи. Поскольку многие методы скрининга и получения доказательств основаны на применении хроматографии в сочетании с масс-спектроскопией, были разработаны рекомендации для идентификации химических соединений с помощью систем ГХ-МС и ЖХ-МС(/МС). Присутствие вещества считается подтвержденным, если по относительной представленности определенного количества характерных ионов (в зависимости от применяемой разновидности масс-спектрометрии) образец сопоставим, с учетом допустимых отклонений, с соответствующим образцом стандарта, подвергнутым аналогичному анализу. Кроме того, время удержания вещества не должно отличаться (в пределах допустимого интервала отклонения) при хроматографическом анализе образца мочи спортсмена и контрольного образца мочи, содержащей искомое вещество. Поэтому для характеристики и идентификации веществ в столь сложных для анализа образцах, как пробы мочи, определяющее значение имеет информация о хроматографических и, особенно, масс-спектрометрических параметрах исследуемых химических соединений. К настоящему времени проведены многочисленные исследования масс-спектрометрических характеристик стимулирующих или маскирующих препаратов, а также разработаны методы их детекции с целью проведения допинг-контроля (Masse et al., 1989; de Boer et al., 1991; Donike et al., 1995; Ayotte et al., 1996; Shackleton et al., 1997; Bowers, 1998; Aguilera et al., 1999; Thevis et al., 2000, 2001, 2002, 2003a).
 
  
−
Далее рассмотрим общие принципы проведения анализа некоторых из этих веществ.
+
== Анаболические препараты ==
  
−
=== Анаболические стероиды ===
 
  
−
Рассматривая статистические данные в отношении результатов проведенных тестов на [[Допинг в спорте|допинг]] и классов выявленных запрещенных веществ, можно заметить, что наиболее часто в качестве допинга в спорте применяют [[анаболические стероиды]]. Например, более 40 % запрещенных субстанций, обнаруженных аккредитоваными [[Допинг в олимпийских играх|МОК]] лабораториями в 2001 г., были анаболическими стероидами. Одним из представителей этой группы является метилтестостерон — производное [[тестостерон]]а, получаемое путем замены метальной группой остатка водорода у С-17. Анаболические стероиды в большинстве своем активно вовлекаются в метаболические процессы, образуя в результате серию метаболитов, например восстановление кетогрупп, окисление гидроксильных групп, гидроксилирование, а также окисление/восстановление связей углерод—углерод в ядре молекулы стероида (Schanzer, 1996). Вслед за этой фазой I метаболизма и перед выделением в составе мочи происходит фаза II метаболизма, а именно конъюгация продуктов фазы I с глюкуропидами или сульфатами.  
+
Учитывая статистическую информацию касательно результатов антидопинговых тестов и классификаций определяемых веществ, находящихся под запретом, можно отметить, что чаще всего самыми используемыми [[Допинг в спорте|допинговыми средствами]], как и прежде являются [[анаболические стероиды|анаболические препараты]]. К примеру, более 45% веществ, находящихся под запретом и выявленных в лабораториях олимпийского комитета, являются анаболическими стероидами. Этот класс веществ принимает активное участие в метаболизме, формируя в итоге подгруппу метаболитов, окисляя при этом гидроксогруппы и восстанавливая углерод-углеродные связи. После этого происходит связывание метаболитов первой фазы с сульфатами.
  
−
Общепринятые стратегии идентификации метаболитов анаболических стероидов основываются на ферментативном гидролизе метаболитов фазы II, в ходе которого образуются метаболиты фазы I, их очистка, концентрация, дериватизация и последующий анализ ГХ-МС. Большинство метаболитов анаболических стероидов, за исключением [[нандролон]]а, о котором речь пойдет ниже, не способны образовываться в организме человека естественным путем, поэтому в случае обнаружения этих соединений в моче спортсмена, подвергнутого допинг-контролю, будет сделано сообщение о положительном результате теста.  
+
Стандартные правила обнаружения метаболитов анаболических веществ опираются на гидролиз с помощью ферментов, в результате которого формируются метаболиты первой фазы, затем проводится очистка, концентрирование, получение производных, а также дальнейшая диагностика путём газовой хроматографии, и масс-спектрометрии. Большая часть метаболитов стероидных веществ, кроме [[нандролон]]а, не синтезируются организмом человека, поэтому при идентификации этих веществ в моче, итогом теста будет положительный результат.
  
−
=== Сконструированные стероиды ===
 
  
−
Проблема применения так называемых сконструированных стероидов (designer steroid) в спорте и в научном мире нарастает подобно снежной лавине после того, как в октябре 2003 г. (Knight, 2003) лаборатория допинг-контроля Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе обнаружила вещество, производное гестринона — лекарственного препарата, применяемого для лечения эндометриоза. Гидрогенирование этинилового остатка, расположенного у 17 углерода этого соединения, приводит к образованию стероидного гормона тетрагидрогестринона (THG), который может рассматриваться как аналог высокоэффективного анаболического стероида [[тренболон]]а, однако клинические исследования физиологического воздействия и побочных эффектов THG никогда не проводились. Общепринятых в исследовательских лабораториях стратегий допинг-контроля, которые до сих пор были направлены на обнаружение прошедших клинические испытания фармацевтических препаратов, оказывается явно недостаточно для преодоления стремления некоторых спортсменов одержать победу пал соперниками обманным путем, подвергая при этом риску собственное здоровье. Учитывая тот факт, что многие процедуры скрининга основаны на сравнении стандартных образцов с пробами мочи с применением таких методик масс-спектрометрии, как мониторинг заданных ионов (selected ion monitoring, SIM) или мониторинг множественных реакций (multiple reaction monitoring, MRM), неизвестные производные или лекарственные препараты, такие, как THG, являются "невидимыми* для стандартных процедур контроля. Это обусловливает необходимость разработки более гибких методик контроля, которые бы позволяли детектировать как известные, так и неизвестные вещества, обладающие сходной структурой, например общее стероидное ядро, что в принципе возможно, в частности, с применением современных систем ГХ-МС/МС.
+
== Дизайнерские стероиды ==
  
−
=== Эндогенные стероиды ===
 
  
−
Если в случае применения анаболических стероидов в моче появляются метаболиты, которые не наблюдаются в норме, применение тестостерона как допинга обнаружить гораздо сложнее, поскольку этот гормон вырабатывается в организме человека. Для этой цели были разработаны различные подходы, наиболее распространенными из которых являются определение соотношения тестостерон/эпитестостерон (Т/Э) и так называемое масс-спектрометрическое измерение соотношения стабильных изотопов углерода (IRMS). Профиль эндогенных стероидов может варьировать в различных ситуациях (Geyer et al., 1996), однако было показано, что соотношение Т/Э является достоверным показателем применения тестостерона как допинга, поскольку продукция эпитестостеропа происходит независимо от тестостерона. В качестве порогового принято значение соотношения Т/Э, равное 6, однако в случае превышения порога позитивный результат теста регистрируется не сразу, спортсмен должен пройти дальнейшее исследование, направленное на контроль естественного повышенного уровня тестостерона.
+
Основной проблемой использования дизайнерских стероидов в профессиональном спорте является их частичная доступность и легальность. В 2003 году антидопинговая лаборатория Калифорнийского университета выявила вещество, образованное от гестринона – медикаментозного препарата, используемого для лечения эндометриоза (разрастание клеток эндометрия у женщин). Гидрогенирование этинилового остатка, находящегося у 17-ой позиции углерода, образует стероидный гормон тетрагидрогестринон, являющийся аналогом сильного анаболического вещества – [[тренболон]]а, при этом испытания на людях с изучением влияния тетрагидрогестринона на организм не проводились. Установленных в лабораториях методов антидопинговой диагностики явно недостаточно для подавления желания некоторых атлетов достичь победы с помощью обмана, рискуя при этом своим здоровьем. Если учесть то, что большинство методов диагностики основываются на сопоставлении стандартных проб с образцами мочи с использованием масс-спектрометрических анализов, например, такого как мониторинг селективных ионов, неопределённые лекарственные средства, к примеру, тетрагидрогестринон, будут не видны для стандартных методов обнаружения. Это предполагает необходимость в создании более совершенных методов обнаружения, позволяющих определять все типы запрещённых веществ, в том числе, и не определяемых ранее, а также тех веществ, которые имеют одинаковое химическое строение.
  
−
Увеличение доступности изотопного анализа методом масс-спектрометрии (IRMS) способствовало проведению ряда исследований, показавших возможность обнаружения различий между эндогенным и синтетическим тестостероном с помощью данного подхода. В частности, было установлено, что природный тестостерон отличается от синтезированных химическим путем аналогов, которые используются как медицинские препараты по соотношению изотопов углерода ,3С/,2С. Применение ГХ с последующим сжиганием анализируемого вещества и анализом образовавшегося при этом диоксида углерода позволяет получать информацию о происхождении тестостерона на основании данных о соотношении изотопов |3С и ,JC (Homing et al., 1998; Aguilera et al., 1999).
 
  
−
=== Диуретики и бета2-агонисты ===
+
== Стероиды, вырабатываемые организмом ==
  
−
К веществам, анализ которых обычно производится посредством ГХ-МС(/МС), относятся также [[Диуретики|диуретик]]и и β2-агонисты. В частности, группа диуретиков характеризуется химическим разнообразием препаратов, назначаемых для сходных или идентичных целей. Для представителей этой группы веществ применяют преимущественно негативную ионизацию (Thieme et al., 2001; Thevis et al., 2002, 2003a), что обусловлено их кислотными свойствами, однако для некоторых диуретиков, в частности триамтерена, требуется позитивная ионизация. Для β2-агонистов основным подходом является протопирование анализируемого вещества с последующей детекцией позитивно заряженной молекулы. Как описано в "[[Допинг-контроль: методы и тесты|Методы анализа]]”, источники ионов, сопрягающие ГХ с МС, обычно позволяют генерировать протонированные или депротонированные молекулы без заметной их фрагментации. Таким образом, структурная информация об анализируемых веществах, специфичность и избирательность масс-анализаторов обеспечиваются применением индуцированной столкновениями диссоциации (CAD) ионизированных препаратов и последующим анализом производных фрагментов. Для этого необходимо иметь сведения про сродство к протонам и поведение продуктов диссоциации после эффективной активации анализируемых молекул с помощью CAD, которая существенно отличается по механизмам фрагментации молекул от электронного удара (EI). Для диуретиков, а также для основной массы β2-агонистов, за исключением салбутамола достаточно проведение качественного анализа. Обычно хроматограммы экстрагированных ионов делают возможной достаточно чувствительную детекцию этих веществ в биологических пробах, а положительный вывод об их наличии делается па основании существенного численного преобладания их результирующих ионов. В 2001 г. около 17,5 % случаев положительных результатов проведенного в 25 аккредитованных МОК лабораториях допинг-контроля относились к применению β2-агонистов, диуретики были обнаружены в 5 % случаев.
 
  
−
== Допинг-контроль: количественный анализ ==
+
Если во время использования анаболических препаратов в моче обнаруживаются метаболиты, не наблюдающиеся в норме, то использование тестостерона в качестве допинга определить уже труднее, так как тестостерон синтезируется эндогенным путём эндокринными железами человека. Для решения этой задачи проводилась разработка различных методов. Самым известными и широко используемыми способами являются измерения баланса тестостерона и эпитестостерона, а также масс-спектрометрия с измерением пропорции устойчивых изотопов углерода. Количество собственных гормонов может колебаться в зависимости от ситуации, однако было установлено, что пропорция тестостерона и эпитестостерона является наилучшим доказательством использования тестостерона в качестве допингового средства, так как выработка эпитестостерона осуществляется вне зависимости от полового гормона тестостерона. Порогом пропорции тестостерона и эпитестостерона является коэффициент 6, но при увеличении коэффициента положительный результат фиксируется не сразу, в дальнейшем спортсмену необходимо также сдать анализ на определение физиологически высокой концентрации тестостерона.
  
−
Для некоторых субстанций, включая стимуляторы, такие, как эфедрин, метаболиты анаболических стероидов, такие, как нандролон, и β2-агонисты, такие, как салбутамол, установлен пороговый уровень, на основании сравнения с которым делается вывод о положительных или отрицательных результатах теста. Основанием для такого решения стали различные причины. Эфедрины входят в состав многих противопростудных лекарственных препаратов, поэтому по антидопинговым правилам их применение является законным, если содержание производных норэфедрина, эфедрина и псевдоэфедрина в моче не превышает 5, 10 или 25 мг-мл'1 соответственно. Салбутамол относится к группе [[Адреномиметические средства|симпатомиметиков]], является одним из 4 разрешенных для использования β2-агонистов (наряду с салметеролом, тербуталином и формотеролом) при условии их применения в виде ингаляции. Поскольку определить, как применялся препарат (орально в виде таблеток или в виде аэрозоля) и в какой дозировке, достаточно сложно, о присутствии салбутамола в пробах во время соревнований сообщают в соответствующую федерацию; если содержание вещества превышает 100 нг-мл'1. В период между соревнованиями установлен пороговый уровень 1 мг-мл"1, поскольку при использовании некоторых симпатомиметиков в дозах, существенно превышающих терапевтические, наблюдаются анаболические эффекты. Присутствие метаболита нандролона 5а-эстраи-За-ол-17-один (норандростерона) в моче профессиональных спортсменов может быть в определенной степени обусловлено эндогенной продукцией, поэтому для этого вещества установлено пороговое содержание 2 иг-мл*1 для мужчин и 5 нг-мл'1 для женщин. Для обоснования полученных значений были проведены многочисленные исследования, также были учтены различные факторы, которые могут влиять на уровень эндогенного образования этого метаболита, например значительный физиологический стресс или беременность, которые приводят к существенному повышению содержания этого вещества в моче. Количественное определение этих соединений осуществляется с использованием калибровочных кривых, которые строят на основании результатов определения стандартными методами соответствующих внутренних стандартов, обладающих сходными или идентичными физико-химическими свойствами (Schanzer, Donike, 1995).
+
Высокая доступность изотопной диагностики с помощью метода масс-спектрального анализа позволила провести несколько исследований, которые показали возможность определения отличий эндогенного тестостерона от искусственного. А именно, было выявлено, что естественный тестостерон имеет специфические отличия от искусственных препаратов тестостерона, использующихся в качестве медикаментозных средств. Использование газовой хроматографии с дальнейшим возгоранием диагностируемого вещества и определением сформировавшегося при этом углекислого газа помогает получать сведения о происхождении тестостерона.
−
== Заключение ==
+
  
−
При проведении допинг-контроля анализ низкомолекулярных соединений основан преимущественно на применении хроматографических и масс-спектрометрических методов, которые делают возможным обнаружение и идентификацию запрещенных препаратов и их метаболитов в пробах биологических жидкостей, таких, как кровь и моча. В то время как в прежние годы анализ проводился главным образом газовой хроматографией с детекцией разделенных продуктов различными анализаторами, например пламенно-ионизационными и азотно-фосфорными детекторами, а также масс-спектрометрическими анализаторами. В последних работах применяется в основном жидкостная хроматография, продукты разделения которой после ионизации при атмосферном давлении подвергаются масс-спектрометрическому анализу, поскольку данный подход позволяет существенно сократить время подготовки образцов и не требует дериватизации анализируемых веществ. Кроме того, благодаря применению тройных квадрупольных анализаторов и ионных ловушек стало возможным осуществление более гибких масс-спектрометрических экспериментов, направленных на определение и характеристику известных лекарственных препаратов, а также неизвестных сконструированных веществ, что также способствует усилению борьбы против допинга и нелегального применения запрещенных препаратов. С момента создания списка запрещенных субстанций и методов стимуляции диапазон веществ, которым уделяется внимание при проведении допинг-контроля, пе перестает изменяться и лабораториям в рамках этого динамического процесса приходится постоянно расширять и модифицировать методы анализа, повышая их чувствительность, специфичность и приспособляемость к решению новых задач, чтобы ограничить злоупотребления лекарственными препаратами в спорте, а также уберечь спортсменов от ложных подозрений. И здесь новые разработки в области высокоскоростной и высокоэффективной хроматографии, масс-спектрометрических, обладающих высоким разрешением и чувствительностью, а также современных приемов ионизации предоставляют аналитическим лабораториям ценные инструменты, которые позволяют получать еще более подробную информацию о примененных веществах, например об их структуре и метаболизме, и расширить временные рамки выявления злоупотреблений стимулирующими препаратами. Поскольку многие препараты, такие, как анаболические стероиды, применяются в период между соревнованиями, но при этом сохраняют свой стимулирующий эффект на протяжении нескольких недель, для полноценного допинг-контроля необходимо проведение анализов как во время соревнований, так и во внесоревновательном периоде. Кроме того, требуется максимальная специфичность и чувствительность аналитических процедур.
 
  
−
== Читайте также ==
+
== Мочегонные средства и бета2-агонисты ==
  
−
*[[Определение (тесты и допинг-контроль) пептидных гормонов]]
+
 
−
*[[Количественный допинг-тест пептидных гормонов]]
+
Мочегонные средства и бета2-агонисты также анализируются путём газовой-хроматографии с применением масс-спектрометрии. Класс мочегонных или диуретических средств отличается большим многообразием препаратов, применяющихся с одной целью – увеличению диуреза. Диуретики чаще всего диагностируются с помощью негативной ионизации, что объясняется их кислотными характеристиками, однако для некоторого количества диуретических препаратов, например, для триамтерена, необходимо проведение позитивной ионизации. Для бета2-агонистов главным методом анализа считается протопирование диагностируемого вещества, с дальнейшим определением молекулы, имеющей положительный заряд. Источники ионов, связывающие применение газовой хроматографии и масс-спектроскопии, как правило способствуют формированию протопированных либо непротопированных молекул без фрагментации. Следовательно, общие сведения о диагностируемых веществах, селективность и специфичность масс-детекторов определяются использованием диссоциации, вызванной ударением молекул ионизированных веществ, и дальнейшей диагностикой фрагментов. Для этого нужно обладать информацией о сродстве веществ с положительно заряженными частицами. Для мочегонных препаратов и для большинства бета2-агонистов (кроме, сальбутамола) будет достаточна реализация качественного анализа. Как правило хроматограммы ионов, подвергшихся экстракции, предоставляют возможность для проведения высокочувствительной идентификации аналогичных субстанций в биологических образцах, положительный же результат анализа основывается на количественном преобладании ионов. В 2001 году порядка 17% зафиксированных положительных результатов теста на допинг были отнесены к использованию бета2-агонистов, диуретические же вещества выявлены в 5 % результатов.
−
*[[Хорионический гонадотропин: допинг-контроль, тесты]]
+
 
−
*[[Эритропоэтин: допинг-контроль, тесты]]
+
 
−
*[[Гормон роста: допинг-контроль, тесты]]
+
= Количественный анализ =
 +
 
 +
 
 +
Для некоторых запрещённых веществ, которые можно обнаружить в биологических жидкостях у спортсменов, (например, для эфедрина, анаболических стероидов и бета2-агонистов) установлено пороговое значение, за счёт которого определяется итоговый результат теста. Эфедрины имеются в составе некоторых антипростудных лекарственных средств, по этой причине их использование в спорте разрешено, если количество производных эфедрина и норэфедрина в образцах мочи не больше 10-15 мг\мл-1. Сальбутамол входит в группу симпатомиметических препаратов, относится к легальным бета2-агонистам, но только при использовании в ингаляционной форме. Так как установить, как именно использовался препарат и его дозировку довольно сложно, о наличии данного лекарственного средства в образцах у спортсменов в соревновательный период докладывается в антидопинговую федерацию, в частности, если концентрация вещества становится больше 100нг\мл-1. В межсоревновательный период установлено предельное содержание сальбутамола – 1 мг\мл-1, так как во время применения некоторых симпатомиметических средств в дозировках, которые значительно превышают лечебные, отмечается анаболическая активность. Наличие метаболита [[нандролон]]а – норандростерона в образцах мочи у спортсменов-профессионалов может объясняться их эндогенной выработкой, поэтому для данного вещества выставлен порог – 2-5 мг\мл-1. Для подтверждения этих показателей было проведено большое количество исследований с учётом различных факторов, которые могли бы воздействовать на степень эндогенной выработки данного метаболита, к примеру, существенное влияние стрессовых факторов, период беременности, оба этих состояния приводят к значительному увеличению уровня норандростерона в образцах мочи. Количественный анализ этих веществ происходит с применением калибровочных кривых, строящихся с учётом результатов выявления стандартных методик.
 +
 
 +
 
 +
= Количественный анализ пептидных гормонов =
 +
 
 +
 
 +
Правила антидопингового олимпийского комитета гласят, что наличие большого количества эндогенных гормонов в крови или их специфических маркеров в биологических жидкостях спортсмена является серьёзным нарушением, приводящим к дисквалификации, исключения составляет присутствие повышенного уровня гормонов в связи с возникшей патологией в организме спортсмена. Однако, в случае использования пептидных гормонов, выражение «высокий уровень гормонов» в большинстве случаев становится неправильным. Выработка большинства пептидных гормонов эндокринными железами осуществляется систематично, то есть уровни гормонов в организме зависят от суточных биоритмов человека. Кроме того, степень синтеза гормонов находится в зависимости не только от пола и возраста, но и от воздействий окружающей среды (температуры, давления и т.д.), стрессоустойчивости, режима сна и бодрствования, рациона и интенсивности физических нагрузок, в том числе и количества тренировочных дней в неделю\месяц. Активность большей части пептидов длится недолго, этот факт тоже влияет на лабильность уровня гормонов в крови. Соответственно, обычная идентификация гормона в организме только лишь в некоторых случаях (ХГЧ у спортсменов-мужчин) помогает сделать вывод об употреблении гормона спортсменом. Несмотря на утверждения, нередко появляющиеся в прессе, повышенный уровень гормона роста у человека, не может являться абсолютным подтверждением применения спортсменом искусственного соматотропина.
 +
 
 +
Ещё одним фактором трудности определения пептидов, является детектирование их аналогов искусственного происхождения, часто применяемых как допинг. Синтезированные при помощи экспрессии животного белка, который кодируется цепочкой человеческой ДНК, искусственные гормоны аналогичны по свойствам и строению естественным гормонам. После введения гормонов в кровь, определить искусственность каждой молекулы гормона практически невозможно.
 +
 
 +
Детекция пептидов в целях осуществления тестов на допинг затрудняется тем, что искусственно созданные гормоны отличаются от эндогенных своей меняющейся структурой и большими размерами. В большинстве своём экзогенные (искусственные) гормоны достаточно быстро подвергаются деградации, включаются в процессы обмена веществ и распадаются. Выделение гормонов почками представляет из себя сложный процесс, механизмы которого до последнего времени так и остаются невыясненными. Помимо этого, содержание пептидов в моче в несколько раз меньше, чем их количество в крови. Получается, что моча – этот тот биоматериал, который, в отличие от проведения стандартных допинг-проверок, не подходит для определения и идентификации пептидных гормонов. Поэтому в данном случае необходимо также взятие анализов крови для подтверждения достоверности тестов.
 +
 
 +
Вдобавок, негативные факторы, относящиеся к разработке допинг-тестов на наличие пептидов, определяются методологическими отличиями в отношении стероидов и пептидов. Стероиды на протяжении нескольких лет идентифицируются в крови с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрического анализа, за счёт этих способов диагностики у сотрудников специализированных лабораторий олимпийского комитета формируется новый опыт. В большинстве случае газовая хроматография и масс-спектрометрия считается эталоном при идентификации гормонов. Однако, данные способы определения никогда не использовались для диагностики пептидов, и на сегодняшний момент ещё не созданы основные постулаты для реализации их допинг-проверки.
 +
 
 +
 
 +
= Заключение =
 +
 
 +
 
 +
Во время проведения антидопинговых проверок оценка низкомолекулярных структур обусловлена в основном использованием газовой или жидкостной хроматографии и методов масс-спектрометрии, благодаря которым возможно определение допинговых веществ в биологических жидкостях (в крови, в моче). Тогда как ранее диагностика проводилась в основном с применением методов газовой хроматографии с определением разделённых веществ разными детекторами (ПИД, АФД и масс-спектрометрия), то в последнее время используется как правило метод жидкостной хроматографии, элементы разделения которой через некоторое время после ионизации под давлением проходят масс-спектрометрию, так как именно этот способ анализа помогает значительно уменьшить время очистки проб крови или мочи и не нуждается в дериватизации диагностируемых веществ. Помимо этого, за счёт использования ионных ловушек и квадрупольных анализаторов становиться возможна реализация самых разнообразных экспериментов с применением масс-спектрометрии, сосредоточенных на идентификации популярных медикаментозных средств, а также неопределённых веществ, что позволяет усилить антидопинговую борьбу. Со времён разработки перечня запрещённых веществ и методик стимуляции охват веществ, которые находятся под наблюдением антидопинговых федераций, практически не меняется, поэтому диагностическим лабораториям из-за постоянно меняющегося диапазона допинговых препаратов необходимо регулярно развивать и пересматривать методы диагностики, увеличивая их показатели чувствительности и специфичности в целях ограничения употребления медикаментозных средств у профессиональных спортсменов во избежание ложных предположений об их репутации. В данном случае новейшие технологии в области хроматографической диагностики и масс-спектрометрии с высокой чувствительностью, а также новых способом ионизации дают диагностическим лабораториям важные инструменты, позволяющие получить ещё более расширенные сведения об используемых веществах, к примеру, об их строении, фармакокинетических и фармакодинамических свойствах, а также увеличить диапазон времени обнаружения длительности использования стимуляторов и других запрещённых субстанций. Так как большинство препаратов, например, анаболические стероиды, используются в предсоревновательный период и при этом не теряют своей эффективности в течение нескольких недель, то для проведения полной антидопинговой проверки в этом случае следует сдача анализов как в соревновательный период, так и в предсоревновательный. Помимо этого, для реализации данной проверки необходима высокочувствительная и специфичная диагностика.
 +
 
 +
 
 +
[[Категория:Здоровье]]  
 +
[[Категория:Книги и журналы]]

Текущая версия на 19:36, 9 декабря 2016

Для многих запрещённых веществ в спорте для получения положительного результата тестов будет достаточно просто получить их наличие в моче. Так как большая часть методов диагностики и определения веществ основываются на использовании хроматографических анализов в комбинации с масс-спектрометрией, были созданы определённые правила для обнаружения химических веществ при помощи систем газовой и жидкостной хроматографии, а также масс-спектрометрии. Наличие вещества подтверждается, если относительная представленность некоего числа определённых ионов (зависит от используемого способа масс-спектрометрии) образца соизмерима с подходящим стандартным образцом. Помимо этого, период удержания веществ не должен сильно различаться (в диапазоне возможных отклонений) во время проведения хроматографии образцов мочи у спортсменов и контрольных образцов. Следовательно, для определения и обнаружения веществ в сложных для диагностики образцах, особую роль играют результаты хроматографии и масс-спектрометрии. На данный момент было проведено большое количество исследований результатов масс-спектрометрии с применением стимуляторов и маскирующих средств, вдобавок были созданы способы их обнаружения для реализации антидопинговых тестов.


Анаболические препараты

Учитывая статистическую информацию касательно результатов антидопинговых тестов и классификаций определяемых веществ, находящихся под запретом, можно отметить, что чаще всего самыми используемыми допинговыми средствами, как и прежде являются анаболические препараты. К примеру, более 45% веществ, находящихся под запретом и выявленных в лабораториях олимпийского комитета, являются анаболическими стероидами. Этот класс веществ принимает активное участие в метаболизме, формируя в итоге подгруппу метаболитов, окисляя при этом гидроксогруппы и восстанавливая углерод-углеродные связи. После этого происходит связывание метаболитов первой фазы с сульфатами.

Стандартные правила обнаружения метаболитов анаболических веществ опираются на гидролиз с помощью ферментов, в результате которого формируются метаболиты первой фазы, затем проводится очистка, концентрирование, получение производных, а также дальнейшая диагностика путём газовой хроматографии, и масс-спектрометрии. Большая часть метаболитов стероидных веществ, кроме нандролона, не синтезируются организмом человека, поэтому при идентификации этих веществ в моче, итогом теста будет положительный результат.


Дизайнерские стероиды

Основной проблемой использования дизайнерских стероидов в профессиональном спорте является их частичная доступность и легальность. В 2003 году антидопинговая лаборатория Калифорнийского университета выявила вещество, образованное от гестринона – медикаментозного препарата, используемого для лечения эндометриоза (разрастание клеток эндометрия у женщин). Гидрогенирование этинилового остатка, находящегося у 17-ой позиции углерода, образует стероидный гормон тетрагидрогестринон, являющийся аналогом сильного анаболического вещества – тренболона, при этом испытания на людях с изучением влияния тетрагидрогестринона на организм не проводились. Установленных в лабораториях методов антидопинговой диагностики явно недостаточно для подавления желания некоторых атлетов достичь победы с помощью обмана, рискуя при этом своим здоровьем. Если учесть то, что большинство методов диагностики основываются на сопоставлении стандартных проб с образцами мочи с использованием масс-спектрометрических анализов, например, такого как мониторинг селективных ионов, неопределённые лекарственные средства, к примеру, тетрагидрогестринон, будут не видны для стандартных методов обнаружения. Это предполагает необходимость в создании более совершенных методов обнаружения, позволяющих определять все типы запрещённых веществ, в том числе, и не определяемых ранее, а также тех веществ, которые имеют одинаковое химическое строение.


Стероиды, вырабатываемые организмом

Если во время использования анаболических препаратов в моче обнаруживаются метаболиты, не наблюдающиеся в норме, то использование тестостерона в качестве допинга определить уже труднее, так как тестостерон синтезируется эндогенным путём эндокринными железами человека. Для решения этой задачи проводилась разработка различных методов. Самым известными и широко используемыми способами являются измерения баланса тестостерона и эпитестостерона, а также масс-спектрометрия с измерением пропорции устойчивых изотопов углерода. Количество собственных гормонов может колебаться в зависимости от ситуации, однако было установлено, что пропорция тестостерона и эпитестостерона является наилучшим доказательством использования тестостерона в качестве допингового средства, так как выработка эпитестостерона осуществляется вне зависимости от полового гормона тестостерона. Порогом пропорции тестостерона и эпитестостерона является коэффициент 6, но при увеличении коэффициента положительный результат фиксируется не сразу, в дальнейшем спортсмену необходимо также сдать анализ на определение физиологически высокой концентрации тестостерона.

Высокая доступность изотопной диагностики с помощью метода масс-спектрального анализа позволила провести несколько исследований, которые показали возможность определения отличий эндогенного тестостерона от искусственного. А именно, было выявлено, что естественный тестостерон имеет специфические отличия от искусственных препаратов тестостерона, использующихся в качестве медикаментозных средств. Использование газовой хроматографии с дальнейшим возгоранием диагностируемого вещества и определением сформировавшегося при этом углекислого газа помогает получать сведения о происхождении тестостерона.


Мочегонные средства и бета2-агонисты

Мочегонные средства и бета2-агонисты также анализируются путём газовой-хроматографии с применением масс-спектрометрии. Класс мочегонных или диуретических средств отличается большим многообразием препаратов, применяющихся с одной целью – увеличению диуреза. Диуретики чаще всего диагностируются с помощью негативной ионизации, что объясняется их кислотными характеристиками, однако для некоторого количества диуретических препаратов, например, для триамтерена, необходимо проведение позитивной ионизации. Для бета2-агонистов главным методом анализа считается протопирование диагностируемого вещества, с дальнейшим определением молекулы, имеющей положительный заряд. Источники ионов, связывающие применение газовой хроматографии и масс-спектроскопии, как правило способствуют формированию протопированных либо непротопированных молекул без фрагментации. Следовательно, общие сведения о диагностируемых веществах, селективность и специфичность масс-детекторов определяются использованием диссоциации, вызванной ударением молекул ионизированных веществ, и дальнейшей диагностикой фрагментов. Для этого нужно обладать информацией о сродстве веществ с положительно заряженными частицами. Для мочегонных препаратов и для большинства бета2-агонистов (кроме, сальбутамола) будет достаточна реализация качественного анализа. Как правило хроматограммы ионов, подвергшихся экстракции, предоставляют возможность для проведения высокочувствительной идентификации аналогичных субстанций в биологических образцах, положительный же результат анализа основывается на количественном преобладании ионов. В 2001 году порядка 17% зафиксированных положительных результатов теста на допинг были отнесены к использованию бета2-агонистов, диуретические же вещества выявлены в 5 % результатов.


Количественный анализ

Для некоторых запрещённых веществ, которые можно обнаружить в биологических жидкостях у спортсменов, (например, для эфедрина, анаболических стероидов и бета2-агонистов) установлено пороговое значение, за счёт которого определяется итоговый результат теста. Эфедрины имеются в составе некоторых антипростудных лекарственных средств, по этой причине их использование в спорте разрешено, если количество производных эфедрина и норэфедрина в образцах мочи не больше 10-15 мг\мл-1. Сальбутамол входит в группу симпатомиметических препаратов, относится к легальным бета2-агонистам, но только при использовании в ингаляционной форме. Так как установить, как именно использовался препарат и его дозировку довольно сложно, о наличии данного лекарственного средства в образцах у спортсменов в соревновательный период докладывается в антидопинговую федерацию, в частности, если концентрация вещества становится больше 100нг\мл-1. В межсоревновательный период установлено предельное содержание сальбутамола – 1 мг\мл-1, так как во время применения некоторых симпатомиметических средств в дозировках, которые значительно превышают лечебные, отмечается анаболическая активность. Наличие метаболита нандролона – норандростерона в образцах мочи у спортсменов-профессионалов может объясняться их эндогенной выработкой, поэтому для данного вещества выставлен порог – 2-5 мг\мл-1. Для подтверждения этих показателей было проведено большое количество исследований с учётом различных факторов, которые могли бы воздействовать на степень эндогенной выработки данного метаболита, к примеру, существенное влияние стрессовых факторов, период беременности, оба этих состояния приводят к значительному увеличению уровня норандростерона в образцах мочи. Количественный анализ этих веществ происходит с применением калибровочных кривых, строящихся с учётом результатов выявления стандартных методик.


Количественный анализ пептидных гормонов

Правила антидопингового олимпийского комитета гласят, что наличие большого количества эндогенных гормонов в крови или их специфических маркеров в биологических жидкостях спортсмена является серьёзным нарушением, приводящим к дисквалификации, исключения составляет присутствие повышенного уровня гормонов в связи с возникшей патологией в организме спортсмена. Однако, в случае использования пептидных гормонов, выражение «высокий уровень гормонов» в большинстве случаев становится неправильным. Выработка большинства пептидных гормонов эндокринными железами осуществляется систематично, то есть уровни гормонов в организме зависят от суточных биоритмов человека. Кроме того, степень синтеза гормонов находится в зависимости не только от пола и возраста, но и от воздействий окружающей среды (температуры, давления и т.д.), стрессоустойчивости, режима сна и бодрствования, рациона и интенсивности физических нагрузок, в том числе и количества тренировочных дней в неделю\месяц. Активность большей части пептидов длится недолго, этот факт тоже влияет на лабильность уровня гормонов в крови. Соответственно, обычная идентификация гормона в организме только лишь в некоторых случаях (ХГЧ у спортсменов-мужчин) помогает сделать вывод об употреблении гормона спортсменом. Несмотря на утверждения, нередко появляющиеся в прессе, повышенный уровень гормона роста у человека, не может являться абсолютным подтверждением применения спортсменом искусственного соматотропина.

Ещё одним фактором трудности определения пептидов, является детектирование их аналогов искусственного происхождения, часто применяемых как допинг. Синтезированные при помощи экспрессии животного белка, который кодируется цепочкой человеческой ДНК, искусственные гормоны аналогичны по свойствам и строению естественным гормонам. После введения гормонов в кровь, определить искусственность каждой молекулы гормона практически невозможно.

Детекция пептидов в целях осуществления тестов на допинг затрудняется тем, что искусственно созданные гормоны отличаются от эндогенных своей меняющейся структурой и большими размерами. В большинстве своём экзогенные (искусственные) гормоны достаточно быстро подвергаются деградации, включаются в процессы обмена веществ и распадаются. Выделение гормонов почками представляет из себя сложный процесс, механизмы которого до последнего времени так и остаются невыясненными. Помимо этого, содержание пептидов в моче в несколько раз меньше, чем их количество в крови. Получается, что моча – этот тот биоматериал, который, в отличие от проведения стандартных допинг-проверок, не подходит для определения и идентификации пептидных гормонов. Поэтому в данном случае необходимо также взятие анализов крови для подтверждения достоверности тестов.

Вдобавок, негативные факторы, относящиеся к разработке допинг-тестов на наличие пептидов, определяются методологическими отличиями в отношении стероидов и пептидов. Стероиды на протяжении нескольких лет идентифицируются в крови с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрического анализа, за счёт этих способов диагностики у сотрудников специализированных лабораторий олимпийского комитета формируется новый опыт. В большинстве случае газовая хроматография и масс-спектрометрия считается эталоном при идентификации гормонов. Однако, данные способы определения никогда не использовались для диагностики пептидов, и на сегодняшний момент ещё не созданы основные постулаты для реализации их допинг-проверки.


Заключение

Во время проведения антидопинговых проверок оценка низкомолекулярных структур обусловлена в основном использованием газовой или жидкостной хроматографии и методов масс-спектрометрии, благодаря которым возможно определение допинговых веществ в биологических жидкостях (в крови, в моче). Тогда как ранее диагностика проводилась в основном с применением методов газовой хроматографии с определением разделённых веществ разными детекторами (ПИД, АФД и масс-спектрометрия), то в последнее время используется как правило метод жидкостной хроматографии, элементы разделения которой через некоторое время после ионизации под давлением проходят масс-спектрометрию, так как именно этот способ анализа помогает значительно уменьшить время очистки проб крови или мочи и не нуждается в дериватизации диагностируемых веществ. Помимо этого, за счёт использования ионных ловушек и квадрупольных анализаторов становиться возможна реализация самых разнообразных экспериментов с применением масс-спектрометрии, сосредоточенных на идентификации популярных медикаментозных средств, а также неопределённых веществ, что позволяет усилить антидопинговую борьбу. Со времён разработки перечня запрещённых веществ и методик стимуляции охват веществ, которые находятся под наблюдением антидопинговых федераций, практически не меняется, поэтому диагностическим лабораториям из-за постоянно меняющегося диапазона допинговых препаратов необходимо регулярно развивать и пересматривать методы диагностики, увеличивая их показатели чувствительности и специфичности в целях ограничения употребления медикаментозных средств у профессиональных спортсменов во избежание ложных предположений об их репутации. В данном случае новейшие технологии в области хроматографической диагностики и масс-спектрометрии с высокой чувствительностью, а также новых способом ионизации дают диагностическим лабораториям важные инструменты, позволяющие получить ещё более расширенные сведения об используемых веществах, к примеру, об их строении, фармакокинетических и фармакодинамических свойствах, а также увеличить диапазон времени обнаружения длительности использования стимуляторов и других запрещённых субстанций. Так как большинство препаратов, например, анаболические стероиды, используются в предсоревновательный период и при этом не теряют своей эффективности в течение нескольких недель, то для проведения полной антидопинговой проверки в этом случае следует сдача анализов как в соревновательный период, так и в предсоревновательный. Помимо этого, для реализации данной проверки необходима высокочувствительная и специфичная диагностика.

Источник — «http://wikiatletics.ru/index.php?title=Допинг-контроль:_количественный_анализ&oldid=42626»