Допинг-контроль: количественный анализ

Для многих запрещённых веществ в спорте для получения положительного результата тестов будет достаточно просто получить их наличие в моче. Так как большая часть методов диагностики и определения веществ основываются на использовании хроматографических анализов в комбинации с масс-спектрометрией, были созданы определённые правила для обнаружения химических веществ при помощи систем газовой и жидкостной хроматографии, а также масс-спектрометрии. Наличие вещества подтверждается, если относительная представленность некоего числа определённых ионов (зависит от используемого способа масс-спектрометрии) образца соизмерима с подходящим стандартным образцом. Помимо этого, период удержания веществ не должен сильно различаться (в диапазоне возможных отклонений) во время проведения хроматографии образцов мочи у спортсменов и контрольных образцов. Следовательно, для определения и обнаружения веществ в сложных для диагностики образцах, особую роль играют результаты хроматографии и масс-спектрометрии. На данный момент было проведено большое количество исследований результатов масс-спектрометрии с применением стимуляторов и маскирующих средств, вдобавок были созданы способы их обнаружения для реализации антидопинговых тестов.

Анаболические препараты

Учитывая статистическую информацию касательно результатов антидопинговых тестов и классификаций определяемых веществ, находящихся под запретом, можно отметить, что чаще всего самыми используемыми допинговыми средствами, как и прежде являются анаболические препараты. К примеру, более 45% веществ, находящихся под запретом и выявленных в лабораториях олимпийского комитета, являются анаболическими стероидами. Этот класс веществ принимает активное участие в метаболизме, формируя в итоге подгруппу метаболитов, окисляя при этом гидроксогруппы и восстанавливая углерод-углеродные связи. После этого происходит связывание метаболитов первой фазы с сульфатами.

Стандартные правила обнаружения метаболитов анаболических веществ опираются на гидролиз с помощью ферментов, в результате которого формируются метаболиты первой фазы, затем проводится очистка, концентрирование, получение производных, а также дальнейшая диагностика путём газовой хроматографии, и масс-спектрометрии. Большая часть метаболитов стероидных веществ, кроме нандролона, не синтезируются организмом человека, поэтому при идентификации этих веществ в моче, итогом теста будет положительный результат.

Дизайнерские стероиды

Основной проблемой использования дизайнерских стероидов в профессиональном спорте является их частичная доступность и легальность. В 2003 году антидопинговая лаборатория Калифорнийского университета выявила вещество, образованное от гестринона – медикаментозного препарата, используемого для лечения эндометриоза (разрастание клеток эндометрия у женщин). Гидрогенирование этинилового остатка, находящегося у 17-ой позиции углерода, образует стероидный гормон тетрагидрогестринон, являющийся аналогом сильного анаболического вещества – тренболона, при этом испытания на людях с изучением влияния тетрагидрогестринона на организм не проводились. Установленных в лабораториях методов антидопинговой диагностики явно недостаточно для подавления желания некоторых атлетов достичь победы с помощью обмана, рискуя при этом своим здоровьем. Если учесть то, что большинство методов диагностики основываются на сопоставлении стандартных проб с образцами мочи с использованием масс-спектрометрических анализов, например, такого как мониторинг селективных ионов, неопределённые лекарственные средства, к примеру, тетрагидрогестринон, будут не видны для стандартных методов обнаружения. Это предполагает необходимость в создании более совершенных методов обнаружения, позволяющих определять все типы запрещённых веществ, в том числе, и не определяемых ранее, а также тех веществ, которые имеют одинаковое химическое строение.

Стероиды, вырабатываемые организмом

Если во время использования анаболических препаратов в моче обнаруживаются метаболиты, не наблюдающиеся в норме, то использование тестостерона в качестве допинга определить уже труднее, так как тестостерон синтезируется эндогенным путём эндокринными железами человека. Для решения этой задачи проводилась разработка различных методов. Самым известными и широко используемыми способами являются измерения баланса тестостерона и эпитестостерона, а также масс-спектрометрия с измерением пропорции устойчивых изотопов углерода. Количество собственных гормонов может колебаться в зависимости от ситуации, однако было установлено, что пропорция тестостерона и эпитестостерона является наилучшим доказательством использования тестостерона в качестве допингового средства, так как выработка эпитестостерона осуществляется вне зависимости от полового гормона тестостерона. Порогом пропорции тестостерона и эпитестостерона является коэффициент 6, но при увеличении коэффициента положительный результат фиксируется не сразу, в дальнейшем спортсмену необходимо также сдать анализ на определение физиологически высокой концентрации тестостерона.

Высокая доступность изотопной диагностики с помощью метода масс-спектрального анализа позволила провести несколько исследований, которые показали возможность определения отличий эндогенного тестостерона от искусственного. А именно, было выявлено, что естественный тестостерон имеет специфические отличия от искусственных препаратов тестостерона, использующихся в качестве медикаментозных средств. Использование газовой хроматографии с дальнейшим возгоранием диагностируемого вещества и определением сформировавшегося при этом углекислого газа помогает получать сведения о происхождении тестостерона.

Мочегонные средства и бета2-агонисты

Мочегонные средства и бета2-агонисты также анализируются путём газовой-хроматографии с применением масс-спектрометрии. Класс мочегонных или диуретических средств отличается большим многообразием препаратов, применяющихся с одной целью – увеличению диуреза. Диуретики чаще всего диагностируются с помощью негативной ионизации, что объясняется их кислотными характеристиками, однако для некоторого количества диуретических препаратов, например, для триамтерена, необходимо проведение позитивной ионизации. Для бета2-агонистов главным методом анализа считается протопирование диагностируемого вещества, с дальнейшим определением молекулы, имеющей положительный заряд. Источники ионов, связывающие применение газовой хроматографии и масс-спектроскопии, как правило способствуют формированию протопированных либо непротопированных молекул без фрагментации. Следовательно, общие сведения о диагностируемых веществах, селективность и специфичность масс-детекторов определяются использованием диссоциации, вызванной ударением молекул ионизированных веществ, и дальнейшей диагностикой фрагментов. Для этого нужно обладать информацией о сродстве веществ с положительно заряженными частицами. Для мочегонных препаратов и для большинства бета2-агонистов (кроме, сальбутамола) будет достаточна реализация качественного анализа. Как правило хроматограммы ионов, подвергшихся экстракции, предоставляют возможность для проведения высокочувствительной идентификации аналогичных субстанций в биологических образцах, положительный же результат анализа основывается на количественном преобладании ионов. В 2001 году порядка 17% зафиксированных положительных результатов теста на допинг были отнесены к использованию бета2-агонистов, диуретические же вещества выявлены в 5 % результатов.

Количественный анализ

Для некоторых запрещённых веществ, которые можно обнаружить в биологических жидкостях у спортсменов, (например, для эфедрина, анаболических стероидов и бета2-агонистов) установлено пороговое значение, за счёт которого определяется итоговый результат теста. Эфедрины имеются в составе некоторых антипростудных лекарственных средств, по этой причине их использование в спорте разрешено, если количество производных эфедрина и норэфедрина в образцах мочи не больше 10-15 мг\мл-1. Сальбутамол входит в группу симпатомиметических препаратов, относится к легальным бета2-агонистам, но только при использовании в ингаляционной форме. Так как установить, как именно использовался препарат и его дозировку довольно сложно, о наличии данного лекарственного средства в образцах у спортсменов в соревновательный период докладывается в антидопинговую федерацию, в частности, если концентрация вещества становится больше 100нг\мл-1. В межсоревновательный период установлено предельное содержание сальбутамола – 1 мг\мл-1, так как во время применения некоторых симпатомиметических средств в дозировках, которые значительно превышают лечебные, отмечается анаболическая активность. Наличие метаболита нандролона – норандростерона в образцах мочи у спортсменов-профессионалов может объясняться их эндогенной выработкой, поэтому для данного вещества выставлен порог – 2-5 мг\мл-1. Для подтверждения этих показателей было проведено большое количество исследований с учётом различных факторов, которые могли бы воздействовать на степень эндогенной выработки данного метаболита, к примеру, существенное влияние стрессовых факторов, период беременности, оба этих состояния приводят к значительному увеличению уровня норандростерона в образцах мочи. Количественный анализ этих веществ происходит с применением калибровочных кривых, строящихся с учётом результатов выявления стандартных методик.

Количественный анализ пептидных гормонов

Правила антидопингового олимпийского комитета гласят, что наличие большого количества эндогенных гормонов в крови или их специфических маркеров в биологических жидкостях спортсмена является серьёзным нарушением, приводящим к дисквалификации, исключения составляет присутствие повышенного уровня гормонов в связи с возникшей патологией в организме спортсмена. Однако, в случае использования пептидных гормонов, выражение «высокий уровень гормонов» в большинстве случаев становится неправильным. Выработка большинства пептидных гормонов эндокринными железами осуществляется систематично, то есть уровни гормонов в организме зависят от суточных биоритмов человека. Кроме того, степень синтеза гормонов находится в зависимости не только от пола и возраста, но и от воздействий окружающей среды (температуры, давления и т.д.), стрессоустойчивости, режима сна и бодрствования, рациона и интенсивности физических нагрузок, в том числе и количества тренировочных дней в неделю\месяц. Активность большей части пептидов длится недолго, этот факт тоже влияет на лабильность уровня гормонов в крови. Соответственно, обычная идентификация гормона в организме только лишь в некоторых случаях (ХГЧ у спортсменов-мужчин) помогает сделать вывод об употреблении гормона спортсменом. Несмотря на утверждения, нередко появляющиеся в прессе, повышенный уровень гормона роста у человека, не может являться абсолютным подтверждением применения спортсменом искусственного соматотропина.

Ещё одним фактором трудности определения пептидов, является детектирование их аналогов искусственного происхождения, часто применяемых как допинг. Синтезированные при помощи экспрессии животного белка, который кодируется цепочкой человеческой ДНК, искусственные гормоны аналогичны по свойствам и строению естественным гормонам. После введения гормонов в кровь, определить искусственность каждой молекулы гормона практически невозможно.

Детекция пептидов в целях осуществления тестов на допинг затрудняется тем, что искусственно созданные гормоны отличаются от эндогенных своей меняющейся структурой и большими размерами. В большинстве своём экзогенные (искусственные) гормоны достаточно быстро подвергаются деградации, включаются в процессы обмена веществ и распадаются. Выделение гормонов почками представляет из себя сложный процесс, механизмы которого до последнего времени так и остаются невыясненными. Помимо этого, содержание пептидов в моче в несколько раз меньше, чем их количество в крови. Получается, что моча – этот тот биоматериал, который, в отличие от проведения стандартных допинг-проверок, не подходит для определения и идентификации пептидных гормонов. Поэтому в данном случае необходимо также взятие анализов крови для подтверждения достоверности тестов.

Вдобавок, негативные факторы, относящиеся к разработке допинг-тестов на наличие пептидов, определяются методологическими отличиями в отношении стероидов и пептидов. Стероиды на протяжении нескольких лет идентифицируются в крови с помощью методов газовой хроматографии и масс-спектрометрического анализа, за счёт этих способов диагностики у сотрудников специализированных лабораторий олимпийского комитета формируется новый опыт. В большинстве случае газовая хроматография и масс-спектрометрия считается эталоном при идентификации гормонов. Однако, данные способы определения никогда не использовались для диагностики пептидов, и на сегодняшний момент ещё не созданы основные постулаты для реализации их допинг-проверки.

Заключение

Во время проведения антидопинговых проверок оценка низкомолекулярных структур обусловлена в основном использованием газовой или жидкостной хроматографии и методов масс-спектрометрии, благодаря которым возможно определение допинговых веществ в биологических жидкостях (в крови, в моче). Тогда как ранее диагностика проводилась в основном с применением методов газовой хроматографии с определением разделённых веществ разными детекторами (ПИД, АФД и масс-спектрометрия), то в последнее время используется как правило метод жидкостной хроматографии, элементы разделения которой через некоторое время после ионизации под давлением проходят масс-спектрометрию, так как именно этот способ анализа помогает значительно уменьшить время очистки проб крови или мочи и не нуждается в дериватизации диагностируемых веществ. Помимо этого, за счёт использования ионных ловушек и квадрупольных анализаторов становиться возможна реализация самых разнообразных экспериментов с применением масс-спектрометрии, сосредоточенных на идентификации популярных медикаментозных средств, а также неопределённых веществ, что позволяет усилить антидопинговую борьбу. Со времён разработки перечня запрещённых веществ и методик стимуляции охват веществ, которые находятся под наблюдением антидопинговых федераций, практически не меняется, поэтому диагностическим лабораториям из-за постоянно меняющегося диапазона допинговых препаратов необходимо регулярно развивать и пересматривать методы диагностики, увеличивая их показатели чувствительности и специфичности в целях ограничения употребления медикаментозных средств у профессиональных спортсменов во избежание ложных предположений об их репутации. В данном случае новейшие технологии в области хроматографической диагностики и масс-спектрометрии с высокой чувствительностью, а также новых способом ионизации дают диагностическим лабораториям важные инструменты, позволяющие получить ещё более расширенные сведения об используемых веществах, к примеру, об их строении, фармакокинетических и фармакодинамических свойствах, а также увеличить диапазон времени обнаружения длительности использования стимуляторов и других запрещённых субстанций. Так как большинство препаратов, например, анаболические стероиды, используются в предсоревновательный период и при этом не теряют своей эффективности в течение нескольких недель, то для проведения полной антидопинговой проверки в этом случае следует сдача анализов как в соревновательный период, так и в предсоревновательный. Помимо этого, для реализации данной проверки необходима высокочувствительная и специфичная диагностика.