Допинг-контроль: методы и тесты

Методы анализа

Первые методы обнаружения допинговых средств основывались на изготовлении препаратов с применением жидкостной экстракции образцов мочи, концентрации и распределении диагностируемых образцов при помощи хроматографических анализов. Для оценки веществ, разъединённых при помощи газовой хроматографии, применялся пламенно-ионизационный детектор, позволяющий обнаруживать наличие стимулирующих веществ амфетаминового ряда. Ещё один вид хроматографического анализа – тонкослойная хроматография использовалась для определения в биологических жидкостях стрихнина, фенилэфрина и бета-гидроксиамфетамина. При получении положительных результатов тестов, дополнительные данные получали при помощи ультрафиолетового спектра, флуоресценции и масс-спектрального анализа. Прогресс в развитии методов анализа и возникновение различных технологий привёл к созданию усложнённых процедур изготовления образцов и формированию новых типов анализа. Вариативность инструментов анализа зависит от параметров диагностируемых веществ.

Начальная хроматография с разделением экстрактов, которые были экстрагированы из биоматериалов (из крови, мочи, волос), является необходимой процедурой для дальнейших анализов. Такой подход помогает получить наиболее точные сведения о диагностируемых веществах. К примеру, разница времени удержания помогает отделить изомеры, помимо этого, таким образом можно разгруппировать вещества, имеющиеся в образцах в малом количестве, от веществ, которые являются большей частью образца. Современная хроматография основана на использовании двух высокоточных методов – газовая и жидкостная хроматография, оба метода достаточно сложные в применении и относятся к отдельным разделам химии.

Метод газовой хроматографии

На данный момент использование капиллярных колонок является наиболее распространённым для реализации газовой хроматографии при проведении антидопинговых проверок. Этот метод обладает высокой эффективностью при разделении компонентов, низким износом оборудования и большим разнообразием неподвижных фаз, что обуславливает большой выбор для разработки методов и реализации полноценного анализа либо для исследования особых веществ. Колонка сделана из 3-х составляющих: внешнее покрытие, сорбирующий слой с кварцем, неподвижная фаза.

Сорбирующий слой с кварцем сделан из сверхчистого стекла с малым количеством металлических примесей. Покрывающий слой за счёт наличия силандиолов обладает достаточно активной поверхностью, реагирующей с диагностируемыми веществами, а точнее с их остатками (гидроксилами, карбоксилами, тиолами и аминами). Из-за такого взаимодействия происходит снижение пиковой интенсивности. Следовательно, во время подготовки колонки к проведению теста дополнительно проводят деактивацию силандиолов при помощи специальных химических средств. В результате получается покрытие, которое будет подходить для взаимодействия с неподвижной фазой.

Неподвижная фаза при проведении хроматографических тестов является важным звеном, так как хроматография измеряет период удержания, степень разделения и визуализирует пики диагностируемых веществ. Данная часть капиллярной колонки сделана из силикона, полиэтиленгликоля или сорбирующего вещества. Как правило, неподвижная фаза используется на основе силикона, потому как этот тип материала имеет хорошую химическую устойчивость и длительный период использования. Общее химическое строение неподвижных фаз представляет собой силиконовую основу, состоящую из последовательности кремния и кислорода с замещающимися группами, которые присоединяются к атомам кремния. Строение и число замещающихся групп – основные характеристики неподвижных фаз. Фазы представлены в основном четырьмя группами: фенильными, метальными, цианопропильными, трифторпропильными. Выборка замещающихся групп и нахождение их в неподвижной фазе указывает на полярность хроматографической колонки. Также, для создания неподвижной фазы в хроматографических колонках применяется полиэтиленгликоль, его главным параметров считается молекулярная масса или длина полимерной цепочки. Главным различием полиэтиленгликоля от силикона является возможность разработки неподвижных фаз с необходимым показателем кислотности, то есть разработка щелочных либо кислотных колонок, показывающих наилучшие результаты при распределении кислот и щелочей. Существенный минус – это повышенная чувствительность к кислороду, в частности при увеличении температуры, приводящей к расформированию неподвижной фазы и сокращению времени эксплуатации колонки. Неподвижная фаза для хроматографической адсорбции представлена мелкими частицами лёгких материалов (к примеру, полимеры, алюминий и т.д.), связывающихся с кварцевым покрытием. За счёт своей повышенной адсорбции в отношении газов, такие неподвижные фазы применяются в основном для хроматографического анализа летучих либо газообразных веществ, так как они плохо взаимодействуют с неподвижной фазой, состоящей из силикона или полиэтиленгликоля, следовательно, температура при разделении вещества должна находиться на отметке 30-35 С. Во время использования капиллярных газово-хроматографических колонок PLOT, всасываемость газообразных веществ будет являться главным механизмом выборки, который поддерживает удержание летучих соединений. Наряду с этим, сильная степень адсорбции диагностируемого компонента на неподвижной фазе запрещает применение таких колонок для разделения наименее летучих молекул.

Внешнее покрытие

Так как капилляры кварцевого сплава имеют достаточно хрупкое строение, то для придания защитных свойств им требуется защитный внешний слой. Для защитных целей как правило применяют полиимиды, которые имеют несколько плюсов. Первый – колонки с полиимидным покрытием обладают высокой прочностью и не нуждаются в чересчур бережном отношении. Второй – полиимидная плёнка закрывает все неровности в капиллярах из кварцевого сплава, тем самым снижая риск дефектности.

После осмотра капиллярной колонки для проведения газово-хроматографического анализа необходимо упомянуть про ещё две характеристики, которые заметно влияют на степень разделения при хроматографии, это габариты колонок и газы-носители.

В то время как габариты колонок, а именно диаметр и длина, оказывают влияние только на величину пиков, то от ширины покрытия неподвижной фазы зависит объём колонки и удержание диагностируемых компонентов. Длина колонки зависит от числа возможных тарелок, соответственно, увеличение длины колонки вдвое (и числа возможных тарелок) может привести к повышению степени разделения на 20-30%. Сокращение длины колонки вдвое приводит к уменьшению степени разделения на 10-20%. Помимо этого, число возможных тарелок находится в обратной зависимости от диаметра колонок, таким образом, уменьшение диаметра повышает точность результатов после газово-хроматографического анализа. Объём колонки измеряется при помощи толщины покрытия неподвижной фазы. В случае если толщина фазы в 0.12-0.18 мкм будет соответствовать анализу 25-55 нг исследуемого вещества, то для осуществления анализа с массой веществ 120 нг, должна быть использована колонка с толщиной фазы 0.55 мкм, таким образом толщину покрытия необходимо подбирать с учётом возможного количества диагностируемых веществ, нанесённых на газово-хроматографическую колонку.

Помимо этого, на характер хроматографии может влиять применяемый газ-носитель. К таким газам относят водород и гелий. Водород способствует поддержанию необходимой скорости процесса, благодаря чему существенно увеличивается качество исполнения. Основной минус водорода - это его быстрая возгораемость.

Метод жидкостной хроматографии

В отличие от газово-хроматографического анализа, жидкостный анализ обладает высокой вариативностью размеров, наполнителей, буферов и растворителей. Кроме того, в жидкостно-хроматографическом методе, зависящем от характеристик диагностируемых веществ, может использоваться целый ряд разнообразных механизмов деления (обращенно-фазовая, ситовая и ионообменная). Чаще всего при проведении антидопинговых проверок применяется именно обращенно-фазовый метод.

Картриджи с колонками различного размера используются в методе жидкостной хроматографии. После модификации материалов-комплектующих (неподвижной фазы) в лабораторных условиях для антидопинговых тестов используются колонки длиной 0.3-1.2 см с D=0.1-0.5 см, причём раньше для проведения жидкостно-хроматографического анализа с высокой эффективностью использовались наиболее ёмкие колонки с увеличенной длиной. Сокращение длины колонок произошло из-за появления высокоспецифичных избирательных масс-спектрометров, позволяющих получить оптимальное деление анализируемых веществ за счёт их спектра, по этой причине необходимость в образцовой хроматографии и делении диагностируемых веществ стала не актуальна. Помимо всего прочего, была значительно улучшена активность колонок для жидкостной хроматографии, что существенно уменьшило период времени сокращения пиков.

Неподвижная фаза является основным параметром хроматографии, в том числе и жидкостной. В данной случае нужно учесть различные показатели, например, длину молекул (3-45мкм), структурные формы носителя (сферическая или иная форма силиконового геля или полиэтиленгликоля), а также присутствие химически связанных компонентов.

Для анализа параметров эффективности колонки зачастую учитывают «число тарелок п» либо «высоту тарелок Н». Уменьшение размера молекул способствует увеличению эффективности хроматографического анализа, в частности, увеличение степени разделения.

Зачастую материалом для создания неподвижной фазы является силикагель (силиконовые частицы). Имеющиеся на рынке разновидности силикагеля различаются по своим параметрам (поверхностная площадь, диаметр, объём).

На данный момент, в качестве переносчика для формирования неподвижной фазы при методе обращенно-фазовой хроматографии применяются шарики силикагеля, так как только при его помощи можно добиться повышенной плотности в отличие от частиц несферической формы. Верхний слой этих частиц состоит из гидроксо-групп, где они могут использоваться для образования химической фазы (эта фаза определяет характеристики колонок для жидкостной хроматографии с высокой эффективностью). Существует большое количество различных фаз, которые помогут найти решение задач при проведении хроматографии или деления веществ. К примеру, нередко используются фазы с присоединёнными С4, С8-группами, или же с наиболее полярными материалами. Кроме этого, были разработаны ещё более многообразные системы, способствующие разделению молекул-стереоизомеров. Наиболее важных достижений в сфере высокоэффективной хроматографии учёные смогли достичь за счёт разработки монолитной колонны, являющейся органическим полимером. Данный материал отличался наиболее высокой устойчивостью и более высокой работоспособностью в отличие от стандартных колонок, наполненных частицами.

Подвижная фаза. При ОФГ неподвижная фаза будет неполярной, и напротив, подвижная – полярной. Зачастую в ОФГ используются буферные системы, которые состоят из гидрофосфатов натрия, калия и ортофосфорной кислоты в комбинации с метиловым спиртом, ацетоном и прочими растворителями, которые подойдут для УФ-детекции. Наряду с этим использование высокоэффективных методов жидкостной хроматографии в комбинации с МС поднимает планку требований к свойствам элюэнтов, так как при применении жидкостной хроматографии необходимо учитывать показатель кислотно-щелочного баланса, свойства растворителя, количество примесей растворителя, а также скорость введения элюзита – все эти параметры следует оптимизировать для достижения наилучших результатов масс-спектрального анализа. Как правило, во время ионизации под давлением с помощью электрораспыления, необходимо введение быстролетучих растворителей во избежание образования примесей ионов определяемых веществ, поэтому нередко используемые фосфатные и сульфатные соединения, сюда не подойдут, им на смену приходят аммониевые соли. Кроме этого, во время ионизации при помощи электрораспыления запрещается использовать такие компоненты, которые образуют неразрывные ионные связи, что впоследствии после удаления приводит к элиминации ионов. Значимая роль отводится поддержанию кислотно-щелочного баланса, а именно, его сохранения во время электрораспыления, так как эта характеристика увеличивает степень ионизации определяемых веществ. Анализ компонентов, которые обладают щелочными свойствами, необходимо осуществлять при сниженном значении рН (в сторону кислотности), поэтому для этого нужно использовать в анализах уксусную или другую органическую кислоту, при этом щелочные соединения лучше всего подвергаются ионизации в щелочах (для создания щелочной среды используют гидрат аммиака). К числу наиболее применяемых растворителей относят метиловый и этиловый спирт, а также этаннитрил (те же растворители, что используются во время проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии).

Детекторы

Детектирование и определение веществ, разделённых на хроматографии, при проведении антидопинговых тестов имеет немаловажное значение. На данный момент создано большое количество детекторов, к ним относят - пламенно-ионизационный детектор, азотно-фосфорный детектор, ультрафиолетовый детектор и также оборудование для проведения масс-спектрального анализа. Помимо этого, в наличии на рынке имеются устройства, соединяющие в себе сразу 2 или более видов детекторов. Также созданы разнообразные системы для определения использования допинговых препаратов, в основу которых входит применение специфических методов изготовления образцов в комбинации с хроматографическим анализом и использованием детекторов, имеющих хорошую чувствительность и точность.

Пламенно-ионизационный детектор (ПИД)

ПИД широко используются в комбинации с газово-хроматографическим анализом на протяжении длительного времени и является одним из наилучших методик анализа. Выходящий из колонки газ диффундирует с водородом и возгорается путём электрического поджига. После сгорания водорода формируется небольшое число ионов, при этом, во время разложения пламени водорода, большая часть органических молекул образует существенное количество электронов, что приводит к повышению проводимости. При подаче тока на коллектор, сила которого равна числу образцов, происходит их нагрев после выхода из колонки. (сила тока определяется при помощи амперметра) Затем ток трансформируется в регистрируемый сигнал и показывается на графике хроматограммы в виде пика.

Азотно-фосфорный детектор (АФД)

АФД является всего лишь разновидностью ПИД. Главное отличие состоит в том, что в данном случае над форсункой горелки находится стеклянный компонент. Дисбаланс водорода и воздуха (в сторону низкого содержания водорода) не способствует удержанию пламени, тем самым снижается ионизация углеводов. При этом щелочные ионы, находящиеся на поверхности стеклянного компонента, содействуют ионизации фосфатсодержащих или азотсодержащих соединений, что облегчает их выборку из числа других анализируемых веществ, относящихся к группе углеводов.

Детектор УФ-лучей

Азотно-фосфорный и пламенно-ионизационный детекторы могут использоваться только с газовой хроматографией, тогда как детектор УФ-лучей используется для анализа в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Механизм его действия основывается на простом масс-спектральном анализе.

В действительности элюмируемые вещества после прохождения высокоэффективной жидкостной хроматографии поступают в ячейку той или иной длины, при этом световой источник начинает испускать ультрафиолетовые лучи, которые проникая через монохроматор достигают ячейки. Сила фото-излучения измеряется при помощи диодов.

Все виды детекторов помогают определить тип веществ, которые были разделены в процессе хроматографии (газовой или жидкостной). Главным минусом описываемых детекторов считается их сниженная спецификация или иными словами нехватка полной информации о диагностируемых веществах. По этой причине оборудование для анализа с методами спектрометрического детектирования стало основным инструментом проведения антидопингового тестирования. В некоторых случаях детекторы используются в комбинации с методами газовой и жидкостной хроматографии, что в конечном счёте приводит к повышению точности тестов. Для детектирования веществ при помощи масс-спектрометрии диагностируемое вещество переводят в ионную форму. Такое возможно за счёт проведения технических манипуляций, происходящих с учётом специфичности хроматографического анализа. В данный момент в оборудовании для газовой хроматографии с анализатором масс-спектрометрии применяется электро-ионизация или химико-ионизация, при этом в высокоточном жидкостно-хроматографическом оборудовании используется ионизация путём электрораспыления, химико-ионизация под давлением и фотоионизация.