Определение (тесты и допинг-контроль) пептидных гормонов

Количественный допинг пептидных гормонов в крови и моче является необходимостью для исследований в области медицины (а именно, в эндокринологии). В лучшем случае такие методики должны иметь высокую специфичность и достоверно определять, а также анализировать уровень того или иного гормона. Методика определения должна быть максимально чувствительна, это необходимо для того, чтобы полностью видеть пептидные гормоны, даже в пониженных количествах. Зачастую уровни гормонов в крови находятся в значении «пмоль\л» или «нмоль\л», поэтому чувствительность определения играет важную роль. Вдобавок, методики количественного определения должны быть достаточно просты в использовании и проводиться в кратчайшие сроки. Подобные методологические принципы измерения уровня гормонов обретают наибольшую значимость, когда анализы проводятся под контролем использования допинга в спортивных дисциплинах. Принимая во внимание все вероятные побочные эффекты от препаратов, а также беря в расчёт политические и денежные нюансы в случае выигрыша спортсмена, применяющего допинг, точность и специфичность методик измерения уровня гормонов в данной области должна быть максимальна. К примеру, для решения финансовых целей, на проведение допинг-проб, нередко применяющихся в медицине, довольно нечасто указывают перекрёстную реактивность молекул пептидных гормонов, при том, что данный параметр является важным звеном при проведении тех же допинг-тестов на определение следующих гормонов (ХГЧ – гонадотропин, соматотропный гормон, гемопоэтин). Также, в соревновательный период нередко проводится масштабная лабораторная диагностика образцов крови и мочи в короткие сроки, для чего опять же необходима быстрая скорость определения уровней гормонов.

В последнее время, аналитические методы определения уровня пептидных гормонов были усовершенствованы, за счёт чего были сокращены сроки и увеличена точность определения. Однако, с тех пор как были открыты методы радиоиммунного анализа и масс-спектрального анализа, остались данные о минусах и ограничениях каждого из них. В ряде случаев, одна из методик не помогает комплексно достичь поставленных задач при диагностике. Несомненно, масс-спектральный анализ – это единственный метод, определяющий с высокой точностью молекулярную структуру веществ. При этом, нынешние методики масс-спектрального анализа, как и прежде сложны в использовании и для их проведения требуется много времени для определения концентрации веществ.

Достигнутый прогресс в использовании масс-спектрального анализа пептидных гормонов не содействовал такому же развитию новых методик исследования при изучении гормональных комбинаций в сыворотке крови, а повышенная точность результатов анализа, достигающаяся при идеальных условиях, вовсе не значит, что метод масс-спектрального анализа приводит к абсолютно точным результатам. Вдобавок, дороговизна технологического оборудования, которое необходимо для проведения масс-спектрального анализа, является существенным минусом в сравнении с другими методиками измерения гормонального уровня. Появление новейших методик исследований с проведением масс-спектрального анализа и созданием нового технологического оборудования, предусмотренного для выполнения высокоточных анализов, с введением роботизированных систем подготовки анализов и повышением их чувствительности, по-видимому может значительно поменять ход диагностических исследований. При этом, на данный момент основная часть анализов на гормоны осуществляется путём иммуноферментного анализа (ИФА).

Основные нюансы проведения ИФА

В иммуноферментном анализе применяется способность антител распознавать и взаимодействовать с особыми структурами молекулы. Связывание антигенов и антител отличается высокой специфичностью. Применение сильнодействующих веществ к антителам помогает существенно увеличить масштабность использования ИФА. Как правило для определения уровня гормонов при использовании ИФА применяют радиоизотопы. При этом, экологичность и экономичность нюансов их применения, в том числе и потенциальная опасность для здоровья способствовали созданию разнообразных методов определения уровня веществ без использования изотопов. В данных системах для определения сигналов применяется либо фотометрический, либо хемилюминесцентный метод, также часто используется процесс флуоресценции. К плюсам таких методик определения относится устойчивость контрастных веществ, так как радиоизотопная метка спустя некоторое время расщепляется и это приводит к существенной вариативности результатов при применении других групп радиоизотопов. В некоторых случаях новые методы определения сигнала без применения изотопов превалируют над чувствительностью самих радиоизотопов, что делает этот метод более привлекательным для использования. В общем степень чувствительности метода иммуноферментного анализа находится в зависимости от аффинности применяемых антител, а зачастую использование какого-либо из видов меток обуславливается лишь наличием в лабораториях необходимого оборудования для количественного анализа.

Технологические нюансы при использовании методик иммуноферментного анализа и их результативность

Методики ИФА можно подразделить на два класса: классический ИФА и сэндвич-метод. В первом случае гормоны, имеющиеся в образцах, претендуют за образование связей с иммуноглобулинами (антителами) с помеченными гормонами, добавленными в реакцию. При высоком уровне гормонов, выработанных в организме, снижается вероятность образования связей с иммуноглобулинами помеченных молекул гормонов, другими словами мощность сигнала, формирующегося во время проведения анализа, обратно пропорциональна уровню гормонов во взятом образце крови. Помимо иммуноферментного анализа проводится также радиоиммунный анализ, люминесцентный анализ и флуоресцентный анализ. Однако, при проведении сэндвич-метода в смеси содержатся неподвижные иммуноглобулины, связывающие гормоны из образца с помеченными определяющими иммуноглобулинами, взаимодействующими с эпитопами молекул гормона, это помогает увидеть количество гормональных молекул, взаимосвязанных с неподвижными иммуноглобулинами. Степень сигнала, связанных помеченных антител, зависит от уровня гормонов, которые связываются с неподвижными иммуноглобулинами. Следовательно, степень определяемого сигнала напрямую зависит от уровня гормонов, находящихся в образцах.

Отличия в выполнении классического иммуноферментного анализа и сэндвич-метода обусловлены возможностью их использования и интерпретацией результатов. Для выполнения классического ИФА необходимо использовать лишь один иммуноглобулин и, соразмерно, один эпитоп; для реализации сэндвич-метода нужны 2 иммуноглобулина и 2 эпитопа. Причём данные эпитопы должны быть распределены в пространстве, так как в противоположном случае образование связей с неподвижным иммуноглобулином препятствует взаимодействию с помеченными антителами, применяющимися для определения уровня гормонов, соответственно, сэндвич-анализ можно использовать при наличии большеразмерных молекул, то есть при определении пептидных гормонов (инсулина, гормона роста). При всём при этом, малоразмерные пептидные гормоны (кортикотропин, кортикорелин, соматрелин и стероиды) зачастую измеряются путём классического иммуноферментного анализа. Плюсом сэндвич-методов является то, что для определения молекул гормона необходимо присутствие 2 эпитопов, что делает данный вид анализа наиболее уникальным и точным, за счёт перекрёстной реактивности пептидных гормонов с аналогичным строением. Помимо этого, в данном случае измеряющийся гормон и «стандартный» гормон (используется для калибровки) аналогичны друг другу, при том, что в классическом ИФА «стандартный» гормон имеет химическую модификацию из-за связывания меток. Такое изменение структуры приводит к появлению отличий в аффинности антител к собственному гормону, находящегося в образцах, и гормону, подвергнувшегося модификации, применяющегося во время классического ИФА.

Стандарты иммуноферментного анализа

Следует упомянуть, что каждый из методов иммуноферментного анализа «относителен» по своей сути. То есть, уровень измеряемого вещества в образцах анализируется в сравнении со стандартным уровнем, либо уровень измеряется за счёт определения способности применяемых антител образовывать связи с гормонами в биологических образцах (к примеру, в сыворотке крови). С теоретической точки зрения принципами количественной оценки являются 3 фактора: 1 – стандартные вещества аналогичны с физической и химической стороны, а также имеют сходства в строении с измеряемым веществом, 2 – эпитопы на молекуле не связаны ни с чем и доступны для связывания с иммуноглобулинами в стандартных и биологических образцах, 3 – вещество, находящееся в стандартном и изучаемом образцах, имеет аналогичные условия (один и тот же раствор). На практике, скорее всего, выполнить условия всех этих трёх принципов при лабораторной диагностике пептидов будет непросто. Одни вещества не имеют определённых стандартов, другие имеют несколько стандартов. К примеру, человеческий гормон роста IRP80-505, экстрагирован из гипофиза, а IRP98-574 является генетически модифицированным белком. Помимо этого, большинство стандартов низкокачественны и имеют большое количество различных примесей (к примеру, IRP ИФР-1 имеет только 35% чистого гормона). Также большие сложности вызывает ситуация, когда многие естественные гормоны, продуцируемые организмом, являются комбинациям различных форм, а не однообразными молекулами. Данный факт был обнаружен по отношении к кортикотропину и гормону роста. Определение какой-либо из форм или комбинаций форм, применяющихся в качестве стандартных образцов, зависит от текущей задачи, которую необходимо решить при измерении уровня гормонов. В начале 90-х учёный-биохимик Экинс, разработавший метод иммуноферментного анализа, выяснил, что применение стандартов ИФА по гетерогенности антигенов полностью исключено.

В отношении второго принципа, необходимо учесть, что для большинства пептидов в кровеносной системе находится несколько эндогенных белков, с которыми можно образовать связи и имеющих большую или меньшую аффинность. Находясь в образцах, данный вид связывающих белков может ограничивать количественный анализ гормонов из-за взаимодействия молекул помеченных пептидов или за счёт предотвращения взаимосвязи гормонов и антител. Присутствие связывающих белков зависит от конкретной методики иммуноферментного анализа и может привести к повышенным или пониженным значениям уровня гормонов при их определении. Вероятность ошибок, увеличивается из-за возможного наличия гетерофильных иммуноглобулинов, которые никак не связаны с измеряемым гормоном. Такие иммуноглобулины способны образовывать связи одновременно с неподвижными и помеченными антителами, что также воздействует на силу сигнала и увеличивает значение уровня гормонов. Было предположено, что возникновение подобных антител в крови наблюдается у людей, у которых имеются домашние животные, однако точная причина их возникновения до сих пор не установлена. Учёные предприняли попытку создания модифицированных методов, позволяющих предотвратить такого рода недочёты, однако, на данный момент, эта проблема ещё не устранена. Вдобавок, раствор, применяющийся для приготовления стандартной смеси, редко аналогичен по своему составу с сывороткой крови человека – в ряде случаев для решения этой задачи используется сыворотка животных, в которой находится достаточное количество альбумина. В другом случае элементы буферной связи воздействуют на появление иммуноглобулинов, что впоследствии приводит к определённой вариативности во время проведения анализа с применением растворов стандартных образцов с разным содержанием.

Так как все вышесказанные факторы способны существенно воздействовать на результаты количественной оценки гормонов, следует очень скрупулёзно интерпретировать полученную информацию, полученную с помощью иммуноферментного анализа. Каждый из методов должен анализироваться с точки зрения вероятности кросс-реактивного взаимодействия используемых веществ, а в идеале знать точные параметры эпитопа, который будет определяться иммуноглобулинами. По-видимому, каждый тип иммуноферментного анализа имеет индивидуальные характеристики и определённую зависимость степени сигнала от уровня какого-либо гормона, поэтому рекомендуется не ссылаться на общепринятые сведения, описанные в руководствах. В конце концов, как и прежде, остаётся немаловажной необходимость разработки IRP для большинства пептидов.

Выводы

Методики проведения ИФА и прочих иммунологических анализов, используемых для измерения пептидов являются достаточно точными средствами количественного теста при определении уровня гормонов в жидкостях организма. Определённая выборка антител, свойства их эпитопов, измерение силы аффинности к измеряемому гормону и обнаружение пептидных гормонов, способных давать кросс-реактивность, поддерживает высокую специфичность при измерении уровня гормонов и делает эти тесты более привлекательными для использования их в качестве допинг-тестов. За счёт своей простоты и скорости, в отличие от остальных методик анализа пептидов, методы иммуноферментного анализа имеют большую значимость при проведении полномасштабных исследований. Наряду с этим, для каждого из видов иммуноферментного анализа должны быть установлены особые уникальные данные. Помимо этого, необходимо установить все факторы, влияющие на точность методов, и создать необходимые условия для их устранения. Следование этим мерам поможет достичь невероятно высокой точности интерпретации результатов иммуноферментного анализа и приобрести возможность применения данного метода для проведения тестов на наличие допинговых препаратов в крови.