Хорионический гонадотропин и эритропоэтин. Допинг-контроль, тесты

Хорионический гонадотропин (ХГЧ) является важным гормоном, синтезирующимся в организме беременных женщин и активизирующим выработку собственных стероидов. Зафиксированы случаи чрезмерного употребления ХГЧ у спортсменов в целях увеличения синтеза собственных андрогенов при поддержании баланса тестостерона и эпитестостерона. Как правило, уровень ХГЧ у женщин вне беременности и у мужчин находится на нижней отметке. Повышенное содержание данного гормона отмечается крайне редко, зачастую при обнаружении онкологических патологий в яичках, поэтому измерение уровня гонадотропина во время тестов на допинг сразу выдаёт спортсмена: наличие ХГЧ у спортсменов мужского пола в больших количествах подразумевает его применение в качестве стимулирующего препарата. Наряду с этим, несмотря на регулярное использование гормона в исследованиях, численное измерение уровня ХГЧ достаточно проблематично. Гонадотропин, относясь к группе гормонов-гликопротеинов, представляет из себя особое соединение, состоящее из 2-ух субъединиц (альфа и бета): альфа-субъединица – основная единица для всех членов этой группы, бета-субъединица способствует образованию связей с рецепторами и указывает на специфичность и активность данного гормона. Карбоксильная часть ХГЧ имеет в себе область, подвергающуюся существенному гликозилированию. Выявлено наличие нескольких форм ХГЧ, а определяемая гетерогенность в гормоне в сильно зависит от нюансов применяемого метода иммунологического анализа. При определении уровня ХГЧ в анализах мочи ситуация складывается не лучшим образом, так как вариативность изоформ метаболитов намного сложнее, в отличие от изоформ, находящихся в крови.

Помимо гетерогенности определяемого гормона большинство стандартов, применяемых с целью калибровки систем анализа гонадотропина, содержат большое количество примесей сторонних вариаций изоформ гормона, взаимодействующих с разной степенью интенсивности с иммуноглобулинами во время проведения всех типов иммунологических анализов. И лишь недавно большая группа учёных смогла разработать 6 стандартных образцов IRP самых значимых изоформ гонадотропина, при их применении должна была увеличиться чувствительность и точность интерпретации результатов.

Также был открыт комбинированный метод с применением масс-спектрометрии, помогающий обосновать положительные результаты анализов на ХГЧ. После специфического гидролиза выявлен маркерный пептид, позволяющий получить для ХГЧ довольно уникальный диапазон конформаций. В комбинации с особым процессом - выделением тканевых антигенов, описываемый способ анализа с применением масс-спектрометрии станет наиболее точным и специализированным при проведении допинг-тестов.

Эритропоэтин: допинг-контроль, тесты

Проведение дополнительных тестов на искусственно введённый эритропоэтин во время Сиднейских Олимпийских игр сыграло важную роль в борьбе с приёмом запрещённых веществ. Данный случай был первым в истории Олимпийских игр, когда в основной программе тестов на допинг был использован анализ, способный определить различия между искусственным и собственным гормоном. В данное время измерение искусственно введённого эритропоэтина обусловлено использованием 2-х непохожих методов. Один из них – образец мочи с применением методов изоэлектрофокусирования и саузерн-блоттинга, которые обеспечивали бы детальную видимость белковых полосок вместе со снижением фонового окрашивания. Основной особенностью данного метода является диагностика форм ЕРО в образце, причём они будут отличаться при определении искусственного и собственного эритропоэтина. Основные аспекты этих отличий состоят в том, что гликозилированные белки по большому счёту находятся в зависимости от типа экспрессированных клеток. Так как искусственно произведённый гормон выводят как правило из яичника хомяков, то процесс гликозилирования белков будет иметь некоторые отличия у человека. Такой метод измерения искусственного эритропоэтина используется не во всех спортивных лабораториях Международного олимпийского комитета.

Главный минус этого метода заключается в дороговизне анализов и продолжительности его проведения. Помимо этого, следы использования допинговых препаратов в организме спортсмена могут быть выявлены лишь на протяжении 4-5 дней после введения средств. В попытках устранить эти недочёты, спортивные эксперты пришли к разработке методик, в основу которых входит определение изменений в показателях крови, вызванных действием эритропоэтина. Установлено, что степень данных изменений существенно увеличивает биологическую вариативность гормонов, а часть изменений отмечается на протяжении месяца после начала использования искусственного эритропоэтина. Новейшие методы определения анализа крови включают в себя измерение ЕРО и определение рецепторов трансферина при помощи иммунологических методов анализа. Несмотря на простоту и низкие затраты при использовании метода, для его осуществления необходим забор крови, помимо этого, при уменьшении порога до нижней отметки, позволяющей отсеять большинство спортсменов, применяющих гормональные препараты, отмечается повышенный риск возникновения ложно положительных результатов. Поэтому на данный момент проведение тестов, в основу которых входит анализ крови, осуществляется для первичного скрининга образцов, имеющих искусственный эритропоэтин, а результаты изоэлектрофокусирования белков, находящихся в анализах мочи, применяются для установления более точных измерений при обнаружении сомнительных образцов.

Учёными выявлено, что применение специфических анализов крови для первичного скрининга помогает значительно сократить расходы на определения положительных образцов путём лабораторной диагностики гормонов в моче. Помимо этого, выполнена масштабная работа, которая была сосредоточена на установлении нормативных сведений и поиска факторов, оказывающих воздействие на результативность анализа. Наряду с этим нужно отметить, что появление искусственного эритропоэтина, найденного в анализах мочи, можно доказать путём проведения изоэлектрофокусирования, которое выявит всю специфичность гликозилирования.

Гормон роста: допинг-контроль, тесты

Применение тестов на допинг на определение человеческого гормона роста в течение нескольких лет являлось нерешаемой проблемой. Совсем недавно спортивные эксперты установили, что как минимум 2 способа помогают определить, использовал ли выступающий спортсмен искусственный гормон роста либо нет. Созданные методики анализа на данный момент подвергаются дополнительной проверке на пригодность, так что в недалеком будущем вероятно эти методики уже будут использоваться как официальный допинг-тест.

Основным минусом анализа на определение гормона роста является то, что не существует такой разновидности допинг-теста, которая помогла бы зафиксировать уровень гормона роста в образцах мочи. Это объясняется тем, что в моче обнаруживаются ничтожно малые, почти незаметные концентрации гормона. Кроме того, выведение гормона роста с мочой является сложным процессом, которому свойственна значительная вариативность, и к тому же, этот процесс недостаточно изучен. Метод изоэлектрофокусирования, используемый при определении ЕРО в образцах мочи, будет недееспособен для определения гормона роста, так как соматотропин не имеет мест гликозилирования. Современные исследования выявили, что молекулы гормона роста, полученного искусственно, имеют такую же идентичность, как и основные фракции соматотропина, вырабатываемого клетками гипофиза.

Однако, несмотря на отсутствие мест гликозилирования, гормон роста в крови находится в виде нескольких изоформ. Изучение этих изоформ не продвинулось также далеко, как изучение ХГЧ, при этом в течение последнего времени у специалистов появилась возможность определять основные элементы. Также, как и основная изоформа с молекулярной массой 22 а.е.м. (атомных единиц массы) и имеющая в себе 191 аминокислотный остаток, в кровотоке обнаруживается другая изоформа с короткой цепочкой аминокислот и с массой 20 а.е.м. Имеются также наиболее короткие изоформы гормона роста, однако они обнаруживаются нерегулярно и ещё не до конца изучены. Несколько изоформы являются продуктами гидролиза или расщепления частиц соматотропного гормона. Изоформы гормона роста существуют в виде полимеров и мономеров, которые состоят из аналогичных или разнообразных димеров.

В большинстве случаев влияние гормона роста на человеческий организм задействует факторы-посредники – ИФР-1 (инсулиноподобный фактор роста-1), образующийся в основном в тканях печени, а также в костной и хрящевой тканях. ИФР высвобождается в общий кровоток, где и вступает во взаимодействие с особыми связывающими белками. Большое значение имеет белок IGFBP3, и также меняющаяся под действием кислот субъединица – ALS, выработка этих двух компонентов происходит при регуляции гормона роста. Во всяком случае для белка IGFBP3 имеются доказательства того, что данный тип белка оказывает особое воздействие вне зависимости от образования связей с ИФР-1 и, следовательно, его можно рассматривать как отдельный пептид. Белок IGFBP3, ALS и ИФР взаимодействуют друг на друга, тем самым увеличивая длительность своего существования, в отличие от времени «жизни» молекул в отдельности.

Одной из тактик выборки нужного допинг-теста для определения большого количества гормона роста в биологических жидкостях является количественный анализ продуктов фармакодинамики соматотропина, а именно вероятное повышение числа элементов связи ALS-IGFBP3-ИФР, которое будет значительно выше естественных показателей. Положительная сторона такого тестирования заключается в том, что период жизнедеятельности продуктов фармакодинамики соматропина был бы дольше активности самого соматотропного гормона, что помогает расширить временные рамки, на протяжении которых имеется вероятность обнаружения искусственно введённого гормона роста в биологических жидкостях. Научные деятели провели несколько масштабных исследований, сконцентрированных на полном изучении продуктов фармакодинамики гормона роста, действие которых зависит от многих факторов, сюда относят физическую активность, пол, возраст и пр. Главной особенностью этих исследований было установление изменений касательно продуктов фармакодинамики гормона, которые происходили при длительном систематическом использовании инъекций соматотропного гормона и имеют характерные особенности, отличающие их от других изменений, спровоцированных физическими нагрузками либо посторонними стимулирующими препаратами. К примеру, была разработана модель анализа, в которой описывалась активность некоторых продуктов фармакодинамики соматотропина с учётом половых отличий. Немаловажную значимость имеет то, что в процессе поиска необходимых факторов был проведён анализ применяемых методов иммунологической диагностики. Не все имеющиеся методики соответствуют определённым требованиям, заявленным в процессе проведения экспериментов, что объясняет необходимость скрупулёзного выбора вариантов иммунологического анализа, которые будут использоваться в будущем. Помимо этого, так как основой описываемого метода является сложнейшая аналитическая модель, нужно учитывать рамки вариативности результатов применяемых методов и обеспечивать регулярное применение в тестировании на допинг специфических иммуноглобулинов. Хотя это может привести к неправильной интерпретации результатов, так как большинство видов иммунологических анализов на данный момент основываются на применении поликлональных антител, при том, что эти антитела невозможно получить в большом количестве. Этот факт помогает разобраться в том, почему все антидопинговые ассоциации ставят на первое место создание технологий без применения поликлональных антител (иммуноглобулинов). После определения всех параметров тестирования, данный метод может быть крайне эффективен в отличие от анализа крови, используемого для определения эритропоэтина.

Существует ещё один метод, специализирующийся на определении гормона роста. Отличием искусственного соматотропина от эндогенных форм, синтезирующихся в гипофизе, является то, что экзогенный гормон существует в одной форме с массой 22 а.е.м. В некоторых источниках говорится о наличии экзогенных гормонов роста с массой 20 а.е.м., однако этот вид гормона ещё не прошёл достаточного количества испытаний на людях. Модифицированный гормон, использующийся для лечения карликовости у детей и других заболеваний касательно недостатка соматотропного гормона, имеет массу 22 а.е.м., следовательно, препараты, применяемые для лечения заболеваний, также используются как стимулирующие агенты в спорте. Подобная гетерогенность у искусственных видов соматотропина, которая как раз и отличает их от биологического многообразия форм гормона, продуцируемых в гипофизе, является основой для проведения дифференциального иммунологического анализа, используемого при допинг-тестировании на выявление экзогенного гормона роста. Поступление в организм человека искусственного соматотропина с массой 22 а.е.м. способствует повышению уровня введённой изоформы в организме. Изменения, наблюдаемые в диапазоне изоформ, впоследствии будут ещё заметнее, если использовать гормон длительное время, так как активация механизма негативной регуляции в данном случае может привести к уменьшению выработки собственного соматотропина в гипофизе. Изучение моноклональных антител, обнаруженных во время применения препаратов гормона роста, позволило выработать 2 способа иммунологического анализа. Первый способ предполагает, что неподвижные антитела будут связывать только изоформы с массой 22 а.е.м., второй способ подразумевает, что эндогенный соматотропный гормон, который представлен несколькими изоформами, будет взаимодействовать с антителами. Оценка образцов крови при помощи двух способов иммунологического анализа помогает измерить относительный уровень соматотропного гормона, состоящего из 22 а.е.м., однако в сравнении с остальными формами. Было установлено, что изменения в разнообразии форм соматотропина обуславливаются только использованием искусственного гормона роста, тогда как при стимуляции выработки после физической нагрузки отмечается повышение числа всех изоформ соматотропина. Кроме того, была значительно увеличена чувствительность изначального метода диагностики. Такая возможность появилась за счёт получения вновь выработанных моноклональных антител. Вместе с этим было составлено несколько тестов, которые подтверждали результаты предыдущих исследований и в основе которых было использование моноклональных антител, имеющих аффинность к различным эпитопам (это является необходимым условием достоверности иммунологического анализа во время допинг-тестов).

Метод дифференциального иммунологического анализа ограничивается в использовании только за счёт проведения антидопинговых проверок, поскольку этот метод не помогает определить какая именно изоформа соматотропного гормона находится в образцах. Помимо этого, по причине малого времени полураспада гормона роста в крови (порядка 10 минут), вероятность определения следов использования искусственного соматотропина ограничивается сутками. Совершенно ясно, что создание новых высокочувствительных методов не поможет избавиться от этих ограничений, так как было выявлено, что после расщепления экзогенных белков и приостановления отрицательного отклика обратной связи, ткани гипофиза вновь приступают к выработке эндогенного соматотропина с обычным спектром изоформ. Однако, с другой стороны, в случае каждодневного использования соматотропина в целях наибольшей стимуляции на организм, повышается риск обнаружения допинговых препаратов при проведении незапланированных тестов за долго до соревновательного периода.

Для использования метода дифференциального иммунологического анализа необходимо также обосновать правомерность других типов иммунологических анализов. Помимо этого, так как осуществляется подсчёт соотношения, следует оценить производимость результатов других методов и при этом учитывать возможное влияние вариативности результатов на показатели соотношения итоговых значений. Значительного уменьшения вариативности результатов не достигнуть в том случае, если при проведении тестов пользоваться одной и той же пластинкой с неподвижными антителами для двух разных тестов, причём первая половина этой пластинки несёт на себе моноклональные антитела для изоформ гормона роста с массой 22 а.е.м., вторая половина – антитела для общего количества соматотропина в организме. После присоединения калибраторов к пластинкам, на всей поверхности происходит равномерное распределение моноклональных антител. Данный порядок использования иммунологического анализа помогает значительно сократить степень вариативности, которая часто возникает при неправильном распределении материала.